一、细胞焦亡（pytoptosis）
细胞焦亡是一种由炎症小体介导的程序性细胞死亡方式，属于程序性坏死的一种。在细胞焦亡过程中，细胞会经历一系列精细调控的分子事件，最终导致细胞结构和功能的不可逆改变。其核心特征是细胞通过释放炎性因子，如白细胞介素 - 1β（IL - 1β）、白细胞介素 - 18（IL - 18）等，这些炎性因子在细胞外环境中发挥关键作用，吸引免疫细胞并激活免疫反应。与此同时，细胞膜发生破裂，细胞内容物包括细胞器碎片、细胞质成分等被释放到细胞外。这种细胞内容物的释放并非随机的，而是与细胞死亡过程中的特定信号通路激活密切相关，它能够进一步激活免疫系统，从而引发强烈的炎症反应，这种炎症反应对于机体清除感染源、维持组织稳态等生理过程具有重要意义，但在某些病理状态下，过度的细胞焦亡和炎症反应也可能导致组织损伤和疾病发生。
二、焦亡关键机制
细胞焦亡是一种具有独特机制的程序性细胞死亡方式，其核心环节紧密相连，共同推动细胞走向死亡并引发炎症反应。以下是细胞焦亡的关键机制： 1、炎症小体激活 炎症小体是细胞内一种多蛋白复合体，如同细胞内的“警报器”，能够感知细胞内外的危险信号。当病原体入侵细胞时，其携带的特定成分，如细菌的脂多糖、病毒的核酸等，会被细胞内的模式识别受体识别。同时，损伤相关分子模式（DAMPs），如细胞内的DNA碎片、ATP等，也会在细胞受损或应激状态下释放出来。此外，一些细胞外的信号刺激，如高浓度的钾离子、氧化应激等，也能被细胞感知。这些因素共同激活细胞内的炎症小体，其中NLRP3炎症小体是最为人们熟知的一种，它能够识别多种不同的危险信号；NLRC4炎症小体则主要针对细菌的鞭毛蛋白等成分发挥作用。
2、Caspase-1活化 炎症小体激活后，会招募并切割前体caspase-1。caspase-1是一种关键的蛋白酶，其前体形式在细胞内处于非活性状态。炎症小体的激活使得前体caspase-1发生构象改变，从而被切割成活性形式。活化的caspase-1就如同一把锋利的“剪刀”，在细胞内发挥着重要的催化作用。它能够进一步切割其他底物蛋白，启动细胞焦亡的级联反应。
3、Gasdermin蛋白孔道形成 活化的caspase-1会切割Gasdermin家族蛋白，其中GSDMD是最为关键的成员。Gasdermin蛋白在正常情况下以非活性形式存在于细胞内。当被caspase-1切割后，Gasdermin蛋白发生构象变化，暴露出其N端的活性结构域。这些活性结构域能够像“钻头”一样，在细胞膜上形成孔道。细胞膜上的孔道一旦形成，细胞内外的物质交换就会失去平衡。细胞内的离子浓度、渗透压等发生剧烈变化，细胞开始肿胀。随着细胞肿胀的加剧，细胞膜的张力不断增加，最终导致细胞破裂。细胞内容物的释放进一步加剧了细胞周围的炎症反应，吸引更多的免疫细胞前来清除病原体和受损细胞。
4、焦亡与凋亡的区别 细胞焦亡和凋亡都是细胞死亡的方式，但它们在形态学和功能上存在显著差异。
①形态学 凋亡细胞通常会表现出细胞皱缩的现象，细胞体积变小，细胞膜出现皱褶。细胞核内的染色质会发生凝集，形成致密的团块。随后，细胞会形成凋亡小体，这些凋亡小体被细胞膜包裹，内容物相对完整，能够被周围的吞噬细胞识别并清除。而焦亡细胞则呈现出完全不同的形态。焦亡细胞会不断膨胀，细胞体积逐渐增大，细胞膜变得脆弱并最终破裂。细胞内的内容物，包括细胞器碎片、细胞质成分等，会大量释放到细胞外，形成一种“爆炸式”的死亡方式。
②.功能 凋亡是一种生理性的细胞死亡过程，主要用于清除体内受损、老化或多余的细胞。凋亡过程中，细胞会通过一系列的信号通路，使得细胞死亡过程相对温和，不会引发强烈的炎症反应。细胞凋亡对于维持组织稳态、发育过程中的细胞重塑等具有重要作用。相比之下，焦亡则是一种具有强烈免疫激活功能的细胞死亡方式。焦亡细胞通过释放炎性因子，如IL-1β、IL-18等，能够吸引大量的免疫细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞等，前来聚集。这些免疫细胞能够进一步清除病原体，参与机体的抗感染免疫反应。在某些病理状态下，焦亡还能够通过激活免疫系统，促进肿瘤细胞的清除，发挥抗肿瘤作用。
三、焦亡检测方法（生化检测）
细胞焦亡的检测是研究其机制和功能的关键环节。以下介绍几种常用的生化检测方法，这些方法能够从不同角度揭示细胞焦亡的发生和程度。
1.Caspase-1活性检测
①.酶活性检测试剂盒 Caspase-1作为细胞焦亡的核心蛋白酶，其活性的检测至关重要。利用酶活性检测试剂盒，可以高效地检测caspase-1的活性。该试剂盒通常使用特定的底物，如Ac-YVAD-AMC。当caspase-1处于活化状态时，它能够特异性地切割该底物，释放出荧光信号。通过荧光光谱仪检测荧光强度，可以定量分析caspase-1的活性水平。这种方法具有高灵敏度和高特异性，能够快速反映细胞焦亡过程中caspase-1的激活程度。
②.Western Blot Western Blot是一种经典的蛋白质检测技术，可用于检测caspase-1的活化。在细胞焦亡过程中，前体caspase-1被炎症小体激活后，会切割成p10和p20两个亚基。通过Western Blot检测cleaved-caspase-1（p10亚基）的表达水平，可以直观地判断caspase-1是否被激活。这种方法不仅能够检测caspase-1的表达量，还能通过条带的大小和强度，进一步分析其活化程度。Western Blot的高分辨率和高特异性使其成为检测caspase-1活化的常用方法。
2.Gasdermin D（GSDMD）切割产物
①.Western Blot Gasdermin D（GSDMD）是细胞焦亡中的关键蛋白，其切割产物是细胞焦亡发生的重要标志。通过Western Blot检测GSDMD被caspase-1切割后的N端片段（约25-30kDa），可以明确GSDMD是否被激活。在正常细胞中，GSDMD以非活性的前体形式存在，当细胞焦亡启动时，caspase-1会特异性地切割GSDMD，释放出其N端活性片段。这些活性片段能够插入细胞膜，形成孔道，导致细胞膜通透性增加。Western Blot检测GSDMD切割产物，不仅可以确定细胞焦亡的发生，还能通过条带的强度比较不同样本之间的焦亡程度。
②.免疫共沉淀（Co-IP） 免疫共沉淀是一种用于检测蛋白质相互作用的技术。通过免疫共沉淀可以验证GSDMD与caspase-1之间的相互作用。在细胞焦亡过程中，GSDMD与caspase-1之间存在直接的相互作用，这种相互作用是GSDMD被切割激活的前提。通过免疫共沉淀实验，可以捕获GSDMD与caspase-1形成的复合体，进一步通过Western Blot检测复合体中各蛋白的表达情况。这种方法不仅能够证实GSDMD与caspase-1之间的相互作用，还能为研究细胞焦亡信号通路中的蛋白相互作用网络提供重要依据。
3.NLRP3炎症小体检测 炎症小体NLRP3是细胞焦亡的关键启动因子。当NLRP3被激活后，能够招募并激活caspase-1，从而启动细胞焦亡程序。通过Western Blot检测NLRP3蛋白的表达水平和焦亡小体的形成情况，可以判断NLRP3炎症小体是否被激活。在Western Blot中，NLRP3蛋白通常以多条带的形式出现，其中焦亡小体条带的出现是NLRP3激活的重要标志。这种方法能够从分子水平上揭示NLRP3炎症小体的激活状态，为研究细胞焦亡的上游信号通路提供重要信息。
4.炎症因子释放 细胞焦亡的一个重要特征是炎性因子的释放。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清中IL-1β、IL-18等炎性细胞因子的释放量，可以评估细胞焦亡的程度。在细胞焦亡过程中，炎症小体激活后会促进IL-1β和IL-18的成熟和分泌。ELISA是一种高灵敏度、高特异性的检测方法，能够定量检测细胞培养上清中这些炎性因子的浓度。通过比较不同处理条件下炎性因子的释放量，可以直观地判断细胞焦亡的发生和程度。这种方法不仅能够反映细胞焦亡的炎症反应特征，还能为研究细胞焦亡在免疫反应中的作用提供重要依据。
5.乳酸脱氢酶（LDH）释放 乳酸脱氢酶（LDH）是一种存在于细胞质中的酶，正常情况下不会释放到细胞外。当细胞焦亡发生时，细胞膜破裂，LDH会释放到培养基中。通过比色法检测LDH活性，可以反映细胞损伤的程度。LDH释放检测是一种简单、快速的细胞损伤检测方法。通过比色法，可以定量检测培养基中LDH的活性水平。这种方法不仅能够反映细胞焦亡导致的细胞膜完整性破坏，还能与其他检测方法结合，全面评估细胞焦亡的发生和程度。
四、焦亡检测方法（形态学）
细胞焦亡的形态学检测方法能够直观地展示细胞在焦亡过程中的结构变化，为研究细胞焦亡提供了重要的可视化证据。以下是几种常用的形态学检测方法：
1.电子显微镜（电镜） 电子显微镜是细胞形态学研究中的重要工具，能够提供高分辨率的细胞内部结构图像。通过透射电镜（TEM）或扫描电镜（SEM），可以观察到细胞焦亡的典型形态特征。在细胞焦亡过程中，细胞会逐渐膨胀，细胞膜出现不规则的孔洞，这些孔洞是由于Gasdermin蛋白形成的孔道。尽管细胞器在早期可能保持相对完整，但随着细胞膜的破裂，细胞内容物会逐渐外泄。透射电镜能够清晰地显示细胞内部的超微结构变化，如线粒体、内质网等细胞器的状态；而扫描电镜则能够提供细胞表面的三维结构信息，直观地展示细胞膜的破裂和内容物的外泄情况。电子显微镜的高分辨率和高对比度使其成为研究细胞焦亡形态学特征的金标准。
2.荧光染色（活细胞成像） 荧光染色是一种常用的细胞形态学检测方法，能够在活细胞状态下实时观察细胞的变化。通过使用特定的荧光染料，可以检测细胞膜的通透性变化，从而反映细胞焦亡的发生。 膜通透性检测：使用荧光染料（如Sytox Green）是一种检测细胞膜完整性丧失的有效方法。Sytox Green是一种细胞膜不可渗透的荧光染料，正常情况下无法进入活细胞。然而，当细胞焦亡发生时，细胞膜破裂，Sytox Green能够穿透细胞膜，与细胞内的DNA结合，发出绿色荧光。通过荧光显微镜或流式细胞术检测绿色荧光的强度和分布，可以直观地判断细胞膜的完整性是否丧失。这种方法不仅能够实时监测细胞焦亡的过程，还能与其他荧光标记物结合，进行多参数分析。
3.Hoechst/PI双染 Hoechst/PI双染是一种经典的细胞死亡检测方法，能够区分细胞焦亡和凋亡。Hoechst染料能够穿透细胞膜，对细胞核进行染色，使细胞核呈现蓝色荧光。PI（碘化丙啶）是一种细胞膜不可渗透的染料，只能进入膜完整性丧失的细胞，使细胞核呈现红色荧光。通过Hoechst和PI的双重染色，结合流式细胞术或荧光显微镜，可以清晰地区分活细胞、凋亡细胞和焦亡细胞。焦亡细胞通常表现为PI染色阳性且细胞形态肿胀，而凋亡细胞则表现为细胞皱缩、染色质凝集。这种方法不仅能够提供细胞死亡的定量分析，还能通过细胞形态的观察，进一步确认细胞焦亡的发生。
4.GSDMD孔道标记 Gasdermin D（GSDMD）是细胞焦亡过程中的关键蛋白，其N端片段在细胞膜上形成孔道，是细胞焦亡的标志性结构。使用针对GSDMD N端的抗体（如抗GSDMD-N抗体）进行免疫荧光染色，可以特异性地标记这些孔道结构。通过荧光显微镜观察，可以清晰地看到GSDMD孔道在细胞膜上的分布和形态。这种方法不仅能够直接证实GSDMD的切割和孔道形成，还能与其他荧光标记物结合，进行多维度的细胞形态学分析。例如，可以将GSDMD孔道标记与细胞膜完整性标记物（如Sytox Green）结合，进一步确认细胞焦亡的发生和程度。